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產(chǎn)品名稱：CuZn/Mn-SOD活性檢測試劑盒(WST-8法)
產(chǎn)品編號：BLGE294
產(chǎn)品規(guī)格：100T
| 產(chǎn)品組成 | BLGE294-100T |
| SOD檢測緩沖液 | 70mL |
| WST-8 | 800μL |
| 酶溶液 | 100μL |
| 反應(yīng)啟動液（40X） | 60μL |
| Cu/Zn-SOD抑制A | 500μL |
| Cu/Zn-SOD抑制B | 500μL |
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說明書 |
產(chǎn)品情況：WST-8的反應(yīng)產(chǎn)物是穩(wěn)定的水溶性產(chǎn)物，可以通過單個時間點的吸光度檢測來測定SOD活力，適合高通量篩選研究。同時WST-8法測定SOD酶活力時，最大抑制百分率可以接近100%，并且可以不受一些常見的干擾因素的干擾，使檢測效果比其它的一些常見方法顯著改善。
本試劑盒的檢測不受樣品中過氧化氫的干擾。很多細(xì)胞和組織樣品中含有內(nèi)源性的過氧化氫，會干擾SOD的檢測。本試劑盒通過添加適量過氧化氫酶等特殊方法，能有效去除常規(guī)樣品中過氧化氫的干擾。例如，對于SOD標(biāo)準(zhǔn)品的檢測，標(biāo)準(zhǔn)品中添加高達0.1mM的過氧化氫時，對于檢測結(jié)果仍無顯著影響。
本試劑盒可以檢測細(xì)胞或組織勻漿液上清、全血、紅細(xì)胞抽提物、血清等生物樣品中的SOD活性。一個試劑盒共可以進行100次檢測。
注意事項：1.待測樣品-70℃可保存1個月。需注意反復(fù)凍融會導(dǎo)致SOD部分失活。
2.Cu/Zn-SOD抑制劑A對人體有刺激性，操作時請小心，并注意適當(dāng)防護以避免直接接觸 人體或吸入體內(nèi)。
3.細(xì)胞或組織等樣品制備時不能采用含有Triton X-100等去垢劑的溶液，否則會干擾本試 劑盒的檢測。
4.抗氧化物會對本試劑盒的檢測產(chǎn)生干擾，例如0.1mM ascorbic acid，5mM GSH都會使測 定出來的吸光度顯著升高。此時盡管樣品沒有顏色，如果設(shè)置了使用說明中的空白對照3， 就可以消除樣品中的抗氧化物的干擾。
5.為了您的健康安全，請穿戴實驗服且佩戴一次性手套進行操作。
儲存運輸：-20℃保存，半年有效。S0103-2 WST-8溶液需避光保存。
產(chǎn)品應(yīng)用：
1. 樣品的準(zhǔn)備：
a. 細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備：收集細(xì)胞，用4℃或冰浴預(yù)冷的PBS或生理鹽水洗滌1-2遍。沉淀用預(yù)冷的PBS在4℃或冰浴進行勻漿(可以使用玻璃勻漿器或各類常見電動勻漿器)。隨后勻漿液4℃離心，取上清作為待測樣品。
b. 組織樣品的準(zhǔn)備：動物用生理鹽水(0.9% NaCl，含有0.16mg/ml肝素鈉)灌流清除血液后獲取組織樣品。取適量的組織樣品，加入4℃或冰浴預(yù)冷的PBS在4℃或冰浴進行勻漿(可以使用玻璃勻漿器或各類常見電動勻漿器)。隨后勻漿液4℃離心，取上清作為待測樣品。
c. 血漿或紅細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備：用抗凝管收集血液，顛倒混勻。4℃ 600g離心10分鐘，移取上清至另一新的1ml離心管中，適量生理鹽水稀釋后即可作為血漿樣本進行檢測。紅細(xì)胞樣品可以參考步驟1a細(xì)胞樣品的制備方法，或其它不含Triton X-100等去垢劑的樣品制備方法。
d. 根據(jù)蛋白濃度和預(yù)計的蛋白使用量，用本試劑盒提供的SOD檢測緩沖液適當(dāng)稀釋樣品。例如，小鼠肝臟組織10%勻漿液(組 織和勻漿液的重量比為10%)上清，通常需要稀釋10-100倍。準(zhǔn)備好的樣品如果當(dāng)天測定，可以冰浴保存；如果當(dāng)天不能 完成測定，可以-70℃凍存，但建議盡量當(dāng)天完成測定。
e. Cu/Zn-SOD的抑制(測定Mn-SOD或Cu/Zn-SOD時選做)：將Cu/Zn-SOD抑制劑A和經(jīng)適當(dāng)稀釋的樣品或標(biāo)準(zhǔn)品按1:24的體 積比(如4μl +96μl)，在離心管內(nèi)或96孔板中混合好，37℃孵育1小時；取20微升Cu/Zn-SOD抑制劑B加入到780微升水中， 混勻，即進行40倍稀釋。然后將已經(jīng)40倍稀釋的Cu/Zn-SOD抑制劑B和上述混合物再按1:25的體積比混合均勻(如 4μl+100μl)，37℃再孵育15分鐘。隨后即可進行步驟3a，或暫時4度或冰浴保存。樣品處理后宜當(dāng)日使用，并盡量在處理 后盡快進行后續(xù)檢測。
注1：稀釋后的Cu/Zn-SOD抑制劑B宜當(dāng)天使用，多余的已稀釋的Cu/Zn-SOD抑制劑B可以直接丟 棄。注2：本試劑盒中提供的Cu/Zn-SOD抑制劑A和抑制劑B用于待測樣品中Cu/Zn-SOD酶活性的抑制；不宜用于添加到 培養(yǎng)的細(xì)胞、組織中，或注射到活體動物中以抑制Cu/Zn-SOD。
2. 試劑盒的準(zhǔn)備工作：
a. WST-8/酶工作液的配制：按照每個反應(yīng)160µl的體積配制適量的WST-8/酶工作液。均勻混合151µl SOD檢測緩沖液、8µl WST-8和1µl酶溶液，即可配制成160µl WST-8/酶工作液。根據(jù)待檢測樣品(包括標(biāo)準(zhǔn)品)的數(shù)量，配制適量的WST-8/酶工 作液。具體配制方法可以參考下表。配制好的WST-8/酶工作液4℃或冰浴保存，可以在當(dāng)天使用，但建議盡量現(xiàn)配現(xiàn)用。
| 待測樣品數(shù)量 | 1 | 10 | 20 | 50 |
| SOD檢測緩沖液 | 151 | 1510 | 3020 | 7550 |
| WST-8（μL） | 8 | 80 | 160 | 400 |
| 酶溶液（μL） | 1 | 10 | 20 | 50 |
| WST-8/酶工作液 | 160 | 1600 | 3200 | 8000 |
b. 反應(yīng)啟動工作液的配制：把試劑盒中的反應(yīng)啟動液(40X)融解后混勻，按照每1µl反應(yīng)啟動液(40X)加入39µl SOD檢測緩沖 液的比例進行稀釋，混勻后即為反應(yīng)啟動工作液。根據(jù)待檢測樣品(包括標(biāo)準(zhǔn)品)的數(shù)量，配制適量的反應(yīng)啟動工作液。 配制好的反應(yīng)啟動工作液4℃或冰浴保存，可以在當(dāng)天使用，但建議盡量現(xiàn)配現(xiàn)用。 c. (可選做)SOD標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)備：需自備SOD標(biāo)準(zhǔn)品，用本試劑盒提供的稀釋液將SOD標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至如下系列濃度：200U/ml，100U/ml，50U/ml，20U/ml，10U/ml，5U/ml，2U/ml。在隨后的檢測中可以各取20微升，參考樣品進行檢測。
說明：為 避免稀釋后SOD酶活性的下降，SOD標(biāo)準(zhǔn)品宜現(xiàn)稀釋現(xiàn)使用；本試劑盒對于SOD的檢測并不需要SOD作為標(biāo)準(zhǔn)品，但可 以使用SOD標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照或作為對SOD活性定量的參考。
3. 樣品測定：
a. 參考下表使用96孔板設(shè)置樣品孔和各種空白對照孔。并按下表依次加入待測樣品和其它各種溶液。加入反應(yīng)啟動工作液 后充分混勻。注意：加入反應(yīng)啟動工作液后反應(yīng)即會開始，可以在低溫操作或用排槍操作以減小各孔間因加入反應(yīng)啟動 工作液的時間先后差異而導(dǎo)致的誤差。
| 樣品 | 空白對照1 | 空白對照2 | 空白對照3 | |
| 待測樣品 | 20μL | - | - | 20μL |
| SOD檢測緩沖液 | - | 20μL | 40μL | 20μL |
| WST-8/酶工作液 | 160μL | 160μL | 160μL | 160μL |
| 反應(yīng)啟動液 | 20μL | 20μL | - | - |
b. 37℃孵育30分鐘。
說明：孵育25至35分鐘檢測出來的SOD活力無顯著差異，但為保證檢測結(jié)果的一致性，推薦孵育30分 鐘。
c. 在450nm測定吸光度。如無450nm濾光片，可以使用420-480nm的濾光片?？梢允褂么笥?00nm的波長作為參考波長進行 雙波長測定。
4. 樣品中總SOD活力的計算
a. 抑制百分率的計算： 參考如下計算公式計算抑制百分率： 抑制百分率＝[(A空白對照1－A空白對照2)－(A樣品－A空白對照3)] / (A空白對照1－A空白對照2) × 100% 如果沒有設(shè)置空白對照3，則可以把計算公式簡化為：抑制百分率 ＝ (A空白對照1－A樣品) / (A空白對照1－A空白對照2) × 100% 如果計算出來的抑制百分率小于30%或大于70%，則通常需要把該樣品重新測定。盡量使樣品的抑制百分率在30-70%范 圍內(nèi)。如果測定出來的抑制百分率偏高，則需適當(dāng)稀釋樣品；如果測定出來的抑制百分率偏低，則需重新準(zhǔn)備濃度較高 的待測樣品。
b. SOD酶活力單位的定義：在上述黃嘌呤氧化酶藕聯(lián)反應(yīng)體系中抑制百分率為50%時，反應(yīng)體系中的SOD酶活力定義為一 個酶活力單位(unit)。
注意：SOD的活力單位的定義方式有很多種，不同的活力單位需根據(jù)其定義的不同進行適當(dāng)換算。
SOD酶活力的計算公式如下：待測樣品中SOD酶活力單位＝檢測體系中SOD酶活力單位＝抑制百分率 / (1－抑制百分率) units 例如，當(dāng)抑制百分率為50%時，待測樣品中SOD酶活力單位＝50% / (1－50%)units＝1 unit；當(dāng)抑制百分率為60%時，待 測樣品中SOD酶活力單位＝60% / (1－60%)units＝1.5 units。
d. 如果樣品為細(xì)胞或組織的勻漿液，可以根據(jù)樣品的蛋白濃度和稀釋倍數(shù)，將SOD活力單位換算為U/g或U/mg蛋白。如果 樣品為紅細(xì)胞抽提液，可以根據(jù)血紅蛋白含量，可換算為U/克血紅蛋白或U/毫克血紅蛋白。 附1：SOD酶活力計算的參考方案：可以先使用本試劑盒繪制SOD標(biāo)準(zhǔn)品的抑制百分率曲線，然后根據(jù)樣品檢測到的抑制百分率對比標(biāo)準(zhǔn)品的抑制百分率曲線計算出樣品中的SOD酶活力單位。本方案僅供參考，使用本試劑盒時不必使用本方案 進行檢測和計算。此外，本方案需確保標(biāo)準(zhǔn)品的酶活力數(shù)據(jù)可靠，不會因為標(biāo)準(zhǔn)品的保存問題而導(dǎo)致實際酶活力下降。
附：SOD酶活力的動力學(xué)檢測：如果條件許可，使用本試劑盒時也可以使用動力學(xué)方法檢測SOD的酶活力。通常在步驟3a 后可以37℃孵育同時在450nm連續(xù)測定吸光度30分鐘。根據(jù)30分鐘內(nèi)的吸光度變化的斜率計算出抑制百分率：抑制百分率＝[(斜率空白對照1－斜率空白對照2)－(斜率樣品－斜率空白對照3)] / (斜率空白對照1－斜率空白對照2)×100%.
其余的計算方法同上述非動力學(xué)的計算方法。動力學(xué)方法的檢測和計算更加精確一些，但檢測起來相對要麻煩一些。使用本試劑盒通常使用非動力學(xué)方法即可。
本產(chǎn)品僅供科研使用，不得用于臨床診斷！